Simple Westernによる総タンパク質ノーマライゼーション (TPN) の自動化
タンパク質発現を定量する際、ハウスキーピングタンパク質は実験条件によって発現量が変動する可能性があるため、総タンパク質ノーマライゼーション（Total Protein Normalization: TPN）はハウスキーピングタンパク質よりも信頼性の高い手法として用いられています。 しかしながら従来のウェスタンブロッティングにおけるTPNでは、時間と手間のかかるゲル染色工程を要する場合が多くありました。 Simple Western™テクノロジーは、再現性の高いTPNとイムノアッセイをシームレスに統合し、これらの課題を解決します。 その結果、サンプル間でタンパク質量が均一であるか素早く確認し、実験セットアップの不備やヒューマンエラーを特定し、ターゲットタンパク質の発現を適切にノーマライズして、より正確で一貫性のある定量データを効率よく取得し、信頼性の高い結果へとつなげます。
Simple Westernによる3つの総タンパク質ノーマライゼーション（TPN）
RePlexモジュールと化学発光検出を用いたTPN
RePlexと化学発光検出を用いたTPNでは、RePlexで化学発光または蛍光によるイムノアッセイを実施した後、抗体を除去し、続いて総タンパク質を化学発光検出します。
RePlexモジュールとNIR蛍光検出を用いたTPN
RePlexとNIR蛍光検出によるTPNでは、RePlexで化学発光または蛍光によるイムノアッセイを実施した後、抗体を除去し、続いて総タンパク質をNIR蛍光検出します。
タンパク質ノーマライゼーション(PN)チャンネル
TPNは、タンパク質ノーマライゼーション (PN)チャンネルを用いて、化学発光、NIR、またはIR蛍光検出のイムノアッセイによる標的タンパク質の検出と、独立した蛍光チャンネルによる同一キャピラリー内での総タンパク質検出を同時に行います。
どのTPNアッセイが最適ですか？*
| RePlexと化学発光検出1 | RePlexとNIR蛍光検出 | タンパク質ノーマライゼーション(PN)チャンネル | |
| 装置 | Jess, Abby, Leo | Jess | Jess |
| サンプル濃度 | 広範囲 | 0.5–2.5 mg/mL | 0.4–1.2 mg/mL |
| 分子量範囲 | 2–440 kDa | 12–440 kDa2 | 2–230 kDa |
| RePlex? | 〇 | 〇 | × |
| イムノアッセイ | 化学発光, NIR蛍光, IR蛍光 (RePlex Probe 1) | 化学発光, NIR蛍光, IR蛍光 (RePlex Probe 1) | 化学発光, NIR蛍光, IR蛍光 |
| 総タンパク質 | 化学発光 (RePlex Probe 2) | NIR (RePlex Probe 2) | PNチャンネル |
RePlexモジュールと化学発光検出を用いたTPN
この方法は、幅広い分子量範囲およびサンプル濃度で検証されており、TPNアッセイ開発の出発点として推奨されます。 RePlexと化学発光検出を組み合わせたTPNでは、RePlexにより化学発光または蛍光免疫アッセイを実施した後、抗体を除去し、続いて総タンパク質を化学発光で検出します。化学発光による総タンパク質アッセイは、Coomassie や SYPRO Rubyによるゲル染色と同様に、ライセート中の全タンパク質を検出します。本アッセイでは、特定のターゲットに対する抗体の代わりに、サンプル中のすべてのタンパク質にビオチンを結合させます。その後、Streptavidin-HRP と Luminol/Peroxideの反応により、捕捉された全タンパク質に対して化学発光シグナルが生成されます。
RePlexモジュールとNIR蛍光検出を用いたTPN
ターゲットタンパク質の発現量が低く、サンプルが高濃度になる時に推奨します。
RePlexとNIR蛍光検出を組み合わせたTPNは、RePlexと化学発光検出によるTPNと同様に、サンプル中の全てのタンパク質にビオチンを結合させて検出します。キャピラリー内に捕捉された全タンパク質をStreptavidin-NIRとインキュベーションすることで、NIR蛍光シグナルが生成されます。本手法は、高濃度サンプル（0.5-2.5 mg/mL）において良好な直線性を示し、低発現量のターゲットタンパク質の分析に適しています。 このプロトコールは、細胞ライセート、脳組織、筋骨格系組織ホモジネートで検証されています。また、高濃度サンプル中で低発現量のターゲットタンパク質を測定するためのTPNアッセイに加え、アッセイセットアップおよびデータ解析に関するヒントも含まれています。
タンパク質ノーマライゼーション(PN)チャンネル
低～中分子量のターゲットタンパク質に推奨されます。
タンパク質ノーマライゼーション(PN)チャンネルを用いたTPNは、化学発光または蛍光プローブを用いたイムノアッセイによるターゲットタンパク質の検出と、同一キャピラリー内での総タンパク質の検出を同時に行います。 PN試薬をアッセイプレートにセットするだけで、以後の工程はJessが自動で処理します。 PN試薬は、イムノアッセイと同じキャピラリー内に固定化されたタンパク質と、一級および二級アミンとの相互作用を介して結合します。
| 対応装置 | Jess |
| サンプル濃度 | 0.2–1.2 mg/mL |
| 分子量範囲 | 2–230 kDa range |
| RePlex?対応 | × |
| マルチプレックスチャンネル | 化学発光, IR蛍光, NIR蛍光 |
| Total protein detectionチャンネル | PN channel |
| 必要な試薬 | Protein Normalization Module |
Bio-Techne.comでの日本語ページをご覧ください