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Novus Biologicals™ Western Blot 工具
Novus Biologicals 为整个 Western Blot 工作流程提供试剂，包括 65,000 多种经 Western Blot 验证的抗体、HRP 偶联二抗、检测试剂及对照，例如阻断肽、对照裂解物和过表达裂解物。
Western Blot 成像与分析
AlphaView® 软件
AlphaView® 软件
Bio-Techne 的 AlphaView 软件支持轻松捕获、分析和注释蛋白质印迹膜和凝胶图像。该软件经优化设计，可与我们的 FluorChem 和 AlphaImager 系统配合使用。
Simple Western™ 系统
Custom Antibody Services
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相关的 Western Blot 资源
Western Blot 指南
Western Blot 指南
Novus Biologicals 的 Western Blot 指南提供了分步讲解，是一份优秀的 Western Blot 测定说明。该指南中提供了详细的信息，以便您了解和执行 Western Blot方案以及排除故障。
Background Information
Western Blot 是一种实验室方法，使用抗体识别细胞或组织裂解物中的单个蛋白质。由于抗体结合的特异性，Western Blot 测定可用于检测和定量数千种不同蛋白质混合物中的单一蛋白质。在 Western Blot 测定中，将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，并通过 SDS-PAGE 电泳根据其分子量进行分离。使用的聚丙烯酰胺凝胶由两部分组成：堆叠凝胶和分离凝胶。堆叠凝胶的丙烯酰胺含量和 pH 值均较低。在这种环境下，样品中的蛋白质会形成清晰明确的锐利条带。蛋白质从堆叠凝胶进入分离凝胶，分离凝胶的碱性和凝胶浓度更高。这导致蛋白质按分子量大小分离，分子量较小的蛋白质通过凝胶的速度更快。然后通过施加电流将蛋白质转移到膜中。可以将膜与具有靶标蛋白质特异性的一抗一起培养。将与酶或荧光染料结合的二抗施加到膜上，以观察蛋白质/抗体复合物。条带将出现的位置对应于大约的蛋白质分子量，如分子量阶梯所示。
什么是 SDS-PAGE？
SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种通常用于按分子量大小分离蛋白质的电泳方法。SDS 是一种阴离子洗涤剂，这种洗涤剂带有负电荷，可与蛋白质结合并破坏负责其三维结构的非共价键，从而使蛋白质变性。SDS 还给蛋白质提供与其分子量大小相关的均匀净负电荷。这导致变性蛋白质在电泳期间仅根据其分子量大小迁移通过凝胶。研究人员通常在 Western Blotting 测定前进行 SDS-PAGE。在 Western Blotting 测定时会将蛋白质从凝胶移动至膜，SDS-PAGE 将分离蛋白质，并利用抗体来确认蛋白质的存在/不存在/表达水平。
什么是原生 PAGE，为什么要使用原生 PAGE？
原生或非变性凝胶不使用 SDS，也没有向样品加载缓冲液中添加还原剂，如 DTT 或 β-巯基乙醇。这意味着蛋白质会保持其天然结构和电荷。因此，蛋白质根据其质量和电荷在电泳期间迁移穿过凝胶。原生凝胶用于确定蛋白质、研究蛋白复合物和分离酶的聚集状态。
Western Blot 测定应加载多少样本?
Western Blot 测定时，上样凝胶中应加载的蛋白量取决于若干因素，包括蛋白表达水平和所探测的样本。根据经验，细胞和核裂解物以及膜样本的每孔加载总蛋白量为 20-30 µg。如果探测纯化蛋白，通常加载 10 至 100 ng 的蛋白量。但是，应该在 Western Blot 实验开始前，确定合适的蛋白加载量。
Western Blot 测定需要什么类型的对照?
适当的 Western Blot 测定对照对于确定问题原因和验证结果非常重要。Western Blot 实验需要使用以下几种对照。
1. 阳性对照裂解物 – 阳性对照裂解物来自已知表达目标蛋白的细胞系或组织样本。该对照在 Western Blot 测定时会产生阳性条带。该对照可确保 Western Blot 方案本身没有问题，并且任何阴性结果都是由于样本中缺乏蛋白质所致，而不是程序问题，因此该对照非常重要。
2. 阴性对照裂解物 – 阴性对照裂解物来自已知不表达目标蛋白的样品。该对照在 Western Blot 测定时不会产生条带。该对照对确定抗体非特异性结合很重要。
3. 阳性内源性对照裂解物 - 阳性内源性对照裂解物来自已知表达靶标的样品。检测重组蛋白样本（如标记的蛋白）时应使用此对照。重组蛋白的折叠可能与天然蛋白不同，并且错误折叠可能会阻止抗体进入表位。此对照能让研究人员了解阴性结果是由于表位被阻断造成的，而不是方案不起作用。
4. 加载对照 – 加载对照是管家基因编码的蛋白，即在几乎所有组织和细胞中以同等水平表达的蛋白。此对照可确保孔间蛋白表达差异不是由于加载或蛋白转移错误导致的。孔间蛋白质水平的半定量分析需要加载对照。
Simple Western 和 Western Blot 有什么区别?
Simple Western 测定是自动化 Western Blot 测定。该平台可自动执行电泳和 Western Blotting 测定涉及的所有步骤，如蛋白质加载和分离、免疫探测、清洗、检测和定量分析数据等。浏览 Novus Biologicals 网站上的 Simple Western 常见问题解答页面，详细了解有关 Simple Western 的信息。
