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蛋白质降解剂
靶向蛋白降解需要使用蛋白质降解剂，以在翻译后实现靶蛋白的强效和选择性敲减。 使用小分子双功能降解剂敲减靶蛋白的多种方式不断涌现，例如处于该领域前沿的 PROTAC® 分子、SNIPER、PHOTAC、Degronimids 和 uSMITEs™。
Bio-Techne 提供广泛的蛋白质降解剂和阴性质控品，以帮助您研究您关注的靶点。
什么是小分子蛋白质降解剂？
图 1：降解剂分子催化作用示意图
蛋白质降解剂是包含 3 种组分的双功能化合物：E3 泛素连接酶配体、连接链和所关注靶蛋白的配体。它们通过同时与 E3 连接酶和靶蛋白结合而诱导形成三元复合物。三元复合物形成有效地“劫持”E3 连接酶对所关注靶蛋白进行多聚泛素化，随后使用 26S 蛋白酶体进行降解。
降解剂可有效用于基础研究，以可逆和可调节的方式诱导选择性蛋白质敲减，而无需对细胞进行基因修饰。降解剂也具有治疗潜力，可用于靶向“不能成药”蛋白组并克服当前治疗常见的耐药机制。
PROTAC® 的概念于 2001 年首次提出。合成的第一代降解剂是基于肽的，并且不具有细胞渗透性，然而它们证明了使用 E3 连接酶降解靶蛋白的原理是可行的。Crews 研究团队还于 2008 年报告了首个小分子蛋白质降解剂。自此之后，科研人员合成了各种降解剂，可以募集不同的 E3 连接酶（包括 Cereblon、von Hippel Lindau (VHL) 和凋亡抑制因子 (IAP)），靶向各种蛋白质靶点（例如酶、受体、溴结构域和转录因子）。
图 2：Wes 数据显示 MOLT-4 细胞经过 200 或 500 nM THAL SNS 032（目录编号 6532）处理后，CDK9 亚型均被敲减。蛋白定量（与仅使用 DMSO 的质控品相比）显示在相应行下方。
实验由 Simple Western™ 应用科学团队进行。Simple Western 全自动 Western Blot 系统提供定量数据，从而可以准确测定蛋白质降解剂的 DC50 和 Dmax 值。
蛋白质降解剂的优势
蛋白质降解剂可方便替代 RNAi 和 CRISPR 等基因编辑方法，实现蛋白质敲减。一些优势总结如下：
- 降解剂使用方便快捷。它们可直接应用于细胞，无需表达载体或转染。
- 可通过改变所使用的降解剂剂量，轻松调节蛋白质降解水平。
- 降解剂可广泛用于不同的细胞系，因为它们不要求细胞必须易于转染。
- 降解剂的作用可在洗脱时逆转，因此作用持续时间易于控制。
- 降解剂能够以亚化学计量浓度使用，可产生显著和持续的作用（源自其催化作用模式）。与小分子抑制剂相比，降解剂可提供更强的选择性。例如，PROTAC® 分子 AT 1（目录编号 6356）是 BRD4 的选择性降解剂，而 AT 1 的靶蛋白配体组分 (+)- JQ1（目录编号 4499）还能抑制密切相关的 BET 溴结构域家族其他蛋白。
使用蛋白质降解剂
降解剂的活性由 DC50 和 Dmax 值表示。DC50 用于衡量效力，是 50% 靶蛋白降解时的降解剂浓度；相当于抑制剂的 IC50。Dmax 是可达到的最大降解水平。这些值可提供有效指导，以确定在实验中使用的降解剂的适当浓度。不同降解剂实现最大降解的时间存在显著差异，在计划实验时也应加以考虑。
很低的降解剂浓度即可实现靶蛋白的有效敲减。某些情况下，在较高剂量下，降解剂表现出“钩状效应”。该效应是指在降解剂浓度较高时，二元复合物的形成增加，与三元复合物的形成产生竞争，导致降解效率降低。
图3：此 Western Blot 表现出所谓的“钩状效应”，显示了降解剂介导的重组 BRD4 的多聚泛素化。CRBN E3 连接酶复合物（目录编号 E3-650）用于研究降解剂诱导的重组 FLAG 标记 BRD4(（目录编号 SP-600）的体外多聚泛素化。结果使用抗 FLAG Western Blot 分析。底物的泛素化程度随反应中使用的降解剂浓度而变化。
分子胶
分子胶是一种小分子蛋白二聚体，通过与 PROTAC® 降解剂类似的机制，实现靶向蛋白降解。然而，分子胶不是嵌合分子。分子胶通过与靶蛋白和 E3 连接酶形成三元复合物来发挥作用，这能导致蛋白质的泛素化，然后被蛋白酶体破坏降解。分子胶与 E3 连接酶相互作用可导致 E3 连接酶结合位点的别构修饰，使得其不能结合天然底物，从而能够与目标蛋白（或新底物）形成三元复合物。与其他小分子蛋白降解剂一样，分子胶也具有催化作用。
Background Information
- LYTAC（LYsosome TArgeting Chimera molecule，溶酶体靶向嵌合体分子）：LYTAC 将胞外目标蛋白转运至溶酶体中进行降解，由威斯康星大学发明。
- PROTAC®（PROteolysis TArgeting Chimeric molecule，蛋白水解靶向嵌合分子）：这一术语在 Craig Crews 实验室（耶鲁大学）2001 年的一篇论文中提出，现被广泛用于指代蛋白降解剂分子。
- SNIPER（Specific and Nongenetic Inhibitor of apoptosis protein (IAP)-dependent Protein ERaser，特异性和非遗传性凋亡蛋白抑制剂 [IAP] 依赖性蛋白擦除剂）：SNIPER 专门募集 E3 连接酶 IAP，由东京大学开发。
- PHOTAC（PHOtochemically TArgeting Chimera，光化学靶向嵌合体）：这些是可由不同波长的光激活的光开关降解剂，由纽约大学开发。
- uSMITE™（Ubiquitin-mediated, Small Molecule-Induced Target Elimination technology，泛素介导的小分子诱导靶标消除技术）：由 Cullgen 开发的一种降解剂。
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Itoh, Y et al. (2010) Protein knockdown using methyl bestatin-ligand hybrid molecules: design and synthesis of inducers of ubiquitination-mediated degradation of cellular retinoic acid-binding proteins. J. Am. Chem. Soc . 132:5820. PMID: 20369832.
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Reynders, M et al. (2020) PHOTACs enable optical control of protein degradation. Sci. Adv. PMID: 32128406.
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Rodriguez-Gonzalez, A et al. (2008) Targeting steroid hormone receptors for ubiquitination and degradation in breast and prostate cancer. Oncogene . PMID: 18794799.
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Sakamoto, K et al. (2001) Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA PMID: 11438690.
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Schneekloth, A et al. (2008) Targeted intracellular protein degradation induced by a small molecule: En route to chemical proteomics. Bioorg. Med. Chem. Lett. PMID: 18752944.
PROTAC® 是 Arvinas Operations, Inc.的注册商标，经许可使用。
