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用于超分辨率显微技术的 Janelia Fluor® 染色剂
Janelia Fluor® 染料在珍利亚研究园区 (Janelia Research Campus) 研发，具有高亮度和高度光稳定性，非常适合 STED、PALM 和 dSTORM 等超分辨率技术。
Janelia Fluor® 染料具有一系列用于生物分子偶联的反应性基团，包括：
偶联方案可在 tocris.com 上获取。
所有胺类活性染料均可转化为相关底物，用于自标记标签系统，例如 HaloTag® 和 SNAP-tag®。
所有图像均由英国埃克塞特大学 C. Soeller 教授提供。拍摄者：Alex Clowsley 和 Anna Meletiou。
SNAP-tag 是 New England BioLabs, Inc 的商标，HaloTag 是 Promega Corporation 的商标。
使用 Janelia Fluor® 染料标记的心脏组织。使用 dSTORM 采集的图像
光活化 Janelia Fluor® 染料
光活化 Janelia Fluor® 染料
光活化的 Janelia Fluor® 染料是 PALM 显微技术中光可激活蛋白的理想替代物。PA Janelia Fluor® 646, SE（目录编号 6150）和 PA Janelia Fluor® 549, SE（目录编号 6149）可用于活细胞和固定细胞，并且可进行多重分析以在活细胞中进行双色单粒子跟踪光敏定位显微技术 (sptPALM)。这些染料分别适用于单分子跟踪和 PALM 和 sptPALM。
特色染料：HM Janelia Fluor® 526
特色染料：HM Janelia Fluor® 526
HM Janelia Fluor® 526, SE（目录编号 7312）是一种自发闪烁的绿色发光染料，是用于 STED 显微技术、单分子定位光谱 (SMLSM) 和 dSTORM 的理想选择。HM Janelia Fluor® 526, SE 具有自发闪烁特性，因而无需使用强效还原的 dSTORM 缓冲液。
Meet MitoBrilliantTM Dyes
Next-generation fluorescent stains for the localization and labeling of mitochondria in both live and fixed cells.
超分辨率显微技术类型和吸头
图 1：点扩散函数。通过介质和透镜的光衍射会引起模糊，这将采集图像的分辨率限制为约 200nm。
超分辨率显微技术是一组技术的总称，这些技术打破了光衍射极限，与传统光学显微技术相比，可以生成分辨率更高的图像。在传统光学显微技术中，图像的分辨率限制在大约 200nm。这是因为当两个结构的距离小于此衍射限值时，它们会模糊成一个光斑，光斑大小称为点扩散函数 (PSF)。图 1.
为了规避点扩散函数带来的限制，超分辨率显微技术会缩小“有效”点扩散函数的大小，或防止样本中的荧光标记在空间或时间上太近，从整体上发挥作用。超分辨率显微技术图像与传统光学显微技术相比，可获得的分辨率提高了约 20 倍，允许研究人员在纳米级研究生物结构和过程，并实现单分子定位和单粒子跟踪。
图 2：STORM 和 dSTORM 显微原理。在 STORM 显微技术中，荧光团会随着时间的推移而受到随机激发。单个荧光团的子集随机“闪烁”，将“关”或“暗”状态间切换为“开”或“发射”状态。此过程重复多次，直到大多数或所有荧光团都被成像。通过捕获每组发射光子的坐标来确定每个荧光团的精确位置。然后，通过专用软件将数据合并，以生成样本的高分辨率图像（在此示例中，对微管蛋白进行成像）。对于 dSTORM，原理与 STORM 显微技术相同，但 dSTORM 使用的荧光团本质上能够进行随机活化，因此不需要活化剂染料。
什么是随机光学重建显微技术或 STORM 显微技术？
随机光学重建显微技术或 STORM 显微技术在一段时间内对可光切换荧光团的子集随机成像，即使在密集标记的样本中，也能实现单个荧光团的空间分辨率。STORM 显微技术是最常用的超分辨率显微技术，产生的图像分辨率高达 5 nm。
STORM 显微技术依赖于染料分子（荧光团）的随机活化，其在开-关状态之间切换（通常称为“闪烁”）。当在一段时间内成像时，顺序激活/失活和时间分辨映射的组合使得研究者可以精确定位荧光团的位置并构建被成像结构的详细图像。由于 STORM 显微技术过程的性质，所使用的荧光团需要具有光稳定性、非常明亮并且能够进行光切换。
成像荧光团必须相隔至少光衍射极限的距离（约为 200nm），使得在一个实例中只有一个荧光团在衍射极限内被激活，否则将发生模糊，并且图像的分辨率将降低。
dSTORM 显微技术：它与 STORM 显微技术有何不同
STORM 显微技术有两种类型，第一种为 STORM，第二种为直接 STORM，也称为 dSTORM。STORM 显微技术涉及一对活化剂-报告剂染料，其中活化剂染料诱导光切换，报告剂染料发射光子。dSTORM 利用能够固有随机活化的荧光团（例如 HM Janelia Fluor® 526, SE，目录编号 7312），因此不需要活化剂染料。
与 STORM 很相似，光激活定位显微技术 (PALM) 和荧光光激活定位显微技术 (FPALM) 依赖于一次捕获少数几个荧光团的发射。在 PALM 中，光活化荧光团先处于非荧光“黑暗”状态，之后通过激光激活来定位。少量的荧光团被随机激活。 使用计算机重建，即可生成分辨率非常高的图像。
图 3：STED 显微技术原理。STED 激光器抑制激发激光器焦点周边周围的光子发射，以有效地降低点扩散函数，从而产生高分辨率图像。
受激发射损耗 (STED) 显微技术如何工作？
受激发射损耗 (STED) 显微技术利用两个激光器通过空间模式激发实现分辨率改善。激发激光器与 STED 激光器同时使用，STED 激光器选择性地抑制或“损耗”激发激光器焦点周边的光子发射。这有效抑制了激发激光焦点周围的荧光团环（“损耗环”），将荧光激发限制在圆环的小中心点。因此，点扩散函数被有效地降低到超越光的自然衍射极限。
STED 显微技术可以实现高达 30 nm 的图像分辨率。为了获得最佳的 STED 效果，染料激发和损耗波长应与所用仪器的规格一致。
使用模式激发的其他类型的超分辨率显微技术包括饱和结构照明显微技术 (SSIM) 和可逆饱和光学线性荧光跃迁 (RESOLFT)。
理想情况下，超分辨率显微技术的荧光团应：非常明亮；具有高度光稳定性（表现出极轻微的光漂白，特别是在常用的含硫醇缓冲液中）；能够以低负载循环随机光切换（意味着在“打开”发射状态下所花费的时间小于在“关闭”非发射黑暗状态下所花费的时间）。
要找到适用于超分辨率显微实验的荧光团，请参阅每个染料产品页面上的应用程序注释，其中您还将找到吸光度和发射光谱、消光系数、量子产率和最近的激光线。
通常需要特定的缓冲液，以允许荧光染料有效地进行光切换。两种最广泛使用的缓冲液包括碱性缓冲系统和巯基乙胺 (MEA) 或 β-巯基乙醇 (BME)。MEA 适用于氧杂蒽类染料（例如 Janelia Fluor® 染料），BME 和 TECEP 缓冲液适用于菁类染料。
如需了解示例缓冲液配方，请阅读：
Dempsey et al (2011) Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods 8 1027 PMID 22056676
Vaughan et al (2013) Phosphine quenching of cyanine dyes as a versatile tool for fluorescence microscopy. J. Am. Chem. Soc. 135 1197 PMID 23311875
Super-Resolution Microscopy Resources
Fluorescent Dyes and Probes Brochure
This product guide provides a comprehensive list and background to the use of fluorescent dyes, probes, stains, and reagents, and contains information on our:
- Fluorescent Dyes, including Dyes for Flow Cytometry
- Fluorescent Probes and Stains, including our new MitoBrilliant™ Mitochondria Stains
- Anti-fade Reagents
- Tissue Clearing Kits and Reagents
- Bioluminescent Substrates
- Aptamer-based RNA Imaging Reagents
- Fluorescent Probes for Imaging Bacteria
- TSA Reagents for Enhancing IHC, ICC & FISH Signals, including TSA Vivid™ Fluorophore Kits
Spectra Viewer
Use our spectra viewer to interactively plan your experiments, assessing multiplexing options. View the excitation and emission spectra for our fluorescent dye range and other commonly used dyes.
超分辨率显微技术参考文献
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Zheng et al. (2019) Rational design of fluorogenic and spontaneously blinking labels for super-resolution imaging. ACS Cent.Sci. 5:1602. PMID: 31572787.
-
Grimm et al. (2017) A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging. Nat. Methods 14:987. PMID: 28869757.
-
Legant et al. (2016) High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes. Nat.Methods 13:359. PMID: 26950745.
-
Grimm et al. (2020) A general method to optimize and functionalize red-shifted rhodamine dyes. Nat.Methods 17:815. PMID: 32719532.
-
Grimm et al. (2016) Bright photoactivatable fluorophores for single-molecule imaging. Nat.Methods 13:985. PMID: 27776112.
-
Long et al. (2020) Super resolution microscopy and deep learning identify Zika virus reorganization of the endoplasmic reticulum. Sci.Rep. 10:20937. PMID: 33262363.
